| name | biologie-moleculaire-techniques |
| description | Compétence niveau ingénieur/docteur en techniques de biologie moléculaire. Couvre PCR, clonage, séquençage, électrophorèse, CRISPR. |
| arxiv_categories | ["q-bio.GN","q-bio.OT"] |
Compétence : Techniques de Biologie Moléculaire
Présentation
Compétence niveau ingénieur/docteur en techniques de biologie moléculaire : PCR, clonage, séquençage, électrophorèse, hybridation, CRISPR.
1. Enzymes de Restriction
| Enzyme | Site | Extrémité |
|---|
| EcoRI | G | AATTC |
| HindIII | A | AGCTT |
| BamHI | G | GATCC |
| SmaI | CCC | GGG |
| NotI | GC | GGCCGC |
2. Électrophorèse
| Support | Gamme | Usage |
|---|
| Agarose | 100 pb-50 kb | ADN génomique, PCR |
| Polyacrylamide | 20-1000 pb | Séquençage |
3. PCR
Cycle (×30-40)
1. Dénaturation : 94-98°C (30 s)
2. Hybridation : 50-65°C (30 s)
3. Élongation : 72°C (30 s/kb)
Variantes
| Type | Usage |
|---|
| RT-PCR | ARNm → ADNc |
| qPCR | Quantification (SYBR Green/TaqMan) |
| Nested | Spécificité accrue |
| Multiplex | Plusieurs cibles |
4. Clonage
Stratégie
Digestion (insert + vecteur) → Ligation (T4, ratio 3:1)
→ Transformation (choc thermique/électroporation)
→ Sélection (antibiotique + X-Gal/IPTG)
→ Vérification (PCR colonies, séquençage)
Assemblage
- Gibson : exonucléase + polymérase + ligase
- Golden Gate : BsaI → digestion + ligation simultanée
- TA Cloning : A-tailing
5. Séquençage
Sanger
- ddNTP terminateurs fluorescents → capillaire → 500-1000 pb
NGS
| Plateforme | Technologie | Lecture |
|---|
| Illumina | Bridge amplification | 2×150 pb |
| PacBio | SMRT | 10-30 kb |
| Nanopore | Courant ionique | 100 kb+ |
6. Hybridation
| Technique | Cible | Détection |
|---|
| Southern | ADN | Sonde ³²P/DIG |
| Northern | ARN | Sonde |
| Western | Protéines | Anticorps + ECL |
| FISH | ADN in situ | Fluorescence |
7. CRISPR-Cas9
Mécanisme
sgRNA + Cas9 → PAM (NGG) → DSB 3 pb avant PAM
→ NHEJ (indels → KO) ou HDR (template → KI)
Variants
| Variant | Fonction |
|---|
| Cas9 nickase | Coupure simple brin |
| dCas9-VP64 | CRISPRa (activation) |
| dCas9-KRAB | CRISPRi (répression) |
| Base Editor | C→T, A→G sans DSB |
| Prime Editor | Insertion/substitution |
8. Références
- Sambrook J. & Green M.R. — Molecular Cloning (4th ed.)
- Jinek M. et al. (2012) — CRISPR-Cas9 — Science (Nobel 2020)
- Addgene : www.addgene.org
- NEB : www.neb.com
